英瀚斯-细胞实验外包-南京细胞实验外包

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状，南京细胞实验外包，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(av1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(av2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo av )

2、在荧光显微镜下采用gfp-lc3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(monitoring) 自噬形成，人们利用lc3在自噬形成过程中发生---的现象开发出了此技术。无自噬时，gfp-lc3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，gfp-lc3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用western blot检测lc3-ii/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型lc3 (即 lc3-i)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即lc3-id，因此，lc3-ii/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: lc3对lc3-ii有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，细胞实验外包，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、mdc (monodansylcadaverine ，单丹---尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特---的。

5、celltrackertm green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特---的。

小鼠成骨细胞和破骨细胞共培养模型的建立

细胞之间的相互调控作用奠定基础.方法利用24 h内新生小鼠颅骨和4~8周龄成年小鼠四肢长分别分离、培养成骨细胞和破骨细胞，采用间接接触的培养模式将接种了骨sui单核细胞的玻片或骨片置入提前24 h接种了成骨细胞的培养皿中进行共培养.共培养-定时间后进行破 骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，trap染色鉴定和骨吸收功能检测，并进一 步采用rt- pcr对破骨细胞标志酶基因基质金属蛋白酶.9(mmp-9)、trap 和组织蛋白酶k (cathepsin k )的表达进行检测结果共培养5天后---trap(+)多核细胞形成13天trap(+ )多核细胞数目达到高峰;骨吸收陷窝在共培养7天后开始出现，随着培养时间的延长，陷窝面积呈增加趋势;破骨细胞标志基因trap在共培养3天时开始表达，而mmp-9和cathepsin k则在共培养5天后表达结论共培养体系中成骨细胞对破骨细胞调控作用------的破骨细胞具有噬骨能力，该共培养模型可用于成骨细胞和破骨细胞之间的相互调控作用研究.