甲l基化特---的pcr
herman 等( 1996 )在使用重---酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高,主要用于作定性研究。用------盐处理基因组dna,所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding,而jia基化的胞嘧定不变;随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物,如果用针对处理后jia基化dna链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在jia基化;反之,说明被检测的位点不存在jia基化。
特点:适用范围广,能够检测特异位点是否发生jia基化。
------盐测序法(bisulfite sequencing pcr,bsp)
------盐修饰后测序法( bsp ) frommer 等( 1992 )提出的研究 dna jia基化方法,此方法---性及jing确度高,能明确目的片段中每一个 cpg 位点的jia基化状态。用------盐处理基因组dna,所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding,而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计bsp引物进行pcr,在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定,zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化,称为bsp-直接测序法。将pcr产物克long至载体后进行测序,可以提高测序成功率,细胞实验外包,这种方法称为bsp-ke隆测序法。
特点:jing确度高,细胞实验外包价格,能够准确检测出jia基化的程度百分比。
蛋白质双向电泳实验流程
1.---yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白
2.双向电泳分离待测样品
(1)一相等电---前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml,否则会造成蛋白质的---或沉淀。
(2)等电---完毕后(约需24hr),若不立即进行第二相电泳,胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电---好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后,细胞实验外包公司选择,于电泳仪上用12.5%sds-page凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5w/胶 45min,15w/胶 5-8hr,20℃。
3.银染法对凝胶进行染色
(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗
3.凝胶扫描及图像分析
(1)图像扫描:凝胶染色后采用image scanner以300dpi,16-bit模式(65536灰阶)进行扫描。
(2)图像分析:扫描完毕后,凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用imagemaster 2d platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30,平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势,目标蛋白质相邻位点的相对一致性,至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。
mirna测序
microrna(mirna)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子rna,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链rna前体经过dicer酶加工后生成,不同于sirna(双链)但是和sirna密切相关。microrna通过和靶基因mrna碱基配对引导沉默复合体(risc)降解mrna或抑制mrna的翻译,从而在转录后水平调控蛋白表达(新发现mirna也能在转录水平调控基因表达)。mirna在物种进化中相当保守,在动物、植物和---等中发现的mirna表达均有严格的组织特---和时序性。mirna在细胞生长和发育过程中起多种作用,包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。
目前研究mirna的方法主要是realtime-pcr、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的mirna测序,南京细胞实验外包,可以一次获得数百万条mirna序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同---状态下已知和未知的mirna及其表达差异,为研究mirna对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。
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