英瀚斯-edu染色检测外包

细胞实验介绍——慢---建立稳转细胞系

慢---包装：公司使用3质粒慢---包装系统，慢---系统使用plko.1-egfp、pspax2、pmd2.g，过表达慢---系统使用plvx-acgfp、pspax2、pmd2.g三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至hek293t细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢---颗粒纯化试剂盒将慢---纯化。纯化后留取部分检测---滴度，其余---冻存于-80℃冰箱中。

滴度检测：将---颗粒使用梯度稀释，分别293t细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算---滴度。

细胞：在---前---对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释---，细胞粘附检测费用，加入12孔板中对细胞进行，---数量根据细胞的moi加入（若无moi，需做---梯度：1，5，10，50，100 5个梯度对细胞），6h后去除含---溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量pcr和western blot检测目的基因的稳定表达情况。

实验流程：慢---质粒构建-hek293t细胞培养-质粒转染293t细胞----收集----纯化----滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定

结果示例：

                                               图 a ---滴度检测；b 目的细胞---效果图

大鼠shen小球内皮细胞分离培养

2.原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:sd大鼠用25%乌拉坦腹整注---zui后仰卧固定。胸腹部消森并分离胸主动脉，以无菌的冷hank液漱朱洗血.同时剪破shen静脉利于液体流出。1-2min后shen脏色泽变白，取出双shen冰浴保存。

(2)shen小球分离:参照green等方法改进。将灌洗后的shen脏撕下shen被膜.去除髓质后将皮质剪成约1-2mm的碎块，轻碾shen皮质依次通过80.120和200目钢筛。收集shen小球。

(3)shen小球---和培养；将提取的shen小球加人0.1% in 型胶原酶---后收集沉淀。以2x10* 的shen小球数接种于铺有1%明胶培养瓶内，加a配制好的内皮细胞培养液(mfm.hepes 20 mmnovl 20%胎牛xue清0. 66 u---/ml.血管内皮生长因子20 ng /ml、---钠100 u/ml.青莓su100 u/ml、链霉su100 μ/ml) .静止培养3 d后逐日观察shen小球的贴壁情况。待shen小球充分贴壁后常规换液.第3同进行纯化。