实时荧光定量pcr-英瀚斯-连云港pcr

18.引物是经过page纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论---析型page变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳，连云港pcr，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，page纯化的引物，---是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少od数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. taqman 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆g-c含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，---是要避免gggg或更多g出现。

◆在引物的5端避免使用g。

◆选用比较多的碱基c。

◆退火温度tm控制在 68-70c   左右。

有用的荧光染料参数

25.pcr扩增不出就引物有问题吗？

答：基本不是。当今发展出各色各样的pcr扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决pcr扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式pcr就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增， gc含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：

（1） rt-pcr。请注意，很多基因通过常规rt -pcr方法是很难扩增出来的。 rt- pcr成功的关键在于rt的反应的rna和目标基因在特定组织和细胞中含量。

（2）从基因组中扩增。一般情况下，实时荧光定量pcr，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组dna过高，会影响反应体系中的mg和ph