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emsa实验

emsa:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和dna序列相结合的技术，初用于研究dna结合蛋白和其相关的dna结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分为2种类型：同位素标记探针，非同位素标记探针。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32p同位素标记的dna或rna探针一同保温，在非变性的聚bing烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。dna-复合物或rna-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的dna结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测rna结合蛋白时，依据目的rna结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的dna或rn片duan和gua核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定dna或rna结合蛋白的特---。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

22.同样的od用page检测，eb染色为什么深浅不一？

答：通常可以用eb染色的方法来判断双链dna的量(如质粒dna)，因为eb可以嵌合到双链dna中。而合成的单链dna，由于碱基组成不同，pcr，形成二级结构的可能性不同，eb的染色程度也会有差异，比如oligo(dt)等不形成二级结构，eb染色效果就非常差。所以不要用eb染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用eb染色来照片不适合所有引物。

23.引物不纯会有什么后果？

答：引物不纯可能会导致：1)非特---扩增；2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开，---是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

答：如果溶解引物的水ph过低或污染了菌或---酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，pcr检测，避免反复冻溶。建议使用10mmt ris ph7.5缓冲液溶解引物，pcr，因为有些蒸馏水的ph值比较低（ph4-5）， 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是pcr使用材料---是模板的与先前使用的不完全一致。