2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ 脱盐
寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的dna结构，首先必须去除保护基团。通过浓---处理，合成的寡核苷酸从固相载体---离，2-乙-----磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（------基和异丁基）被去除，pcr检测，从而形成了天然的dna结构。然而，---的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ｐｃｒ检测等基础生物研究。
◆ biorp / opc纯化
如果寡核苷酸以“三---”的形式合成，则n-寡核苷酸包含5’-dmt基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为dmt基有强的亲脂的特性，有5’-dmt基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－dmt寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含dmt基团，所以，我们能够成功的把想要的n-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。
13.合成的引物5端是否有磷酸化
答：合成的引物5为---，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，上海pcr，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要---引物退火的条件。sirna分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
甲l基化特---的pcr
herman 等（ 1996 ）在使用重---酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用------盐处理基因组dna，---怎么做，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行pcr。通过电泳检测msp扩增产物，如果用针对处理后jia基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。
特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。
------盐测序法（bisulfite sequencing pcr，bsp）
------盐修饰后测序法（ bsp ） frommer 等（ 1992 ）提出的研究 dna jia基化方法，此方法---性及jing确度高，---多少钱，能明确目的片段中每一个 cpg 位点的jia基化状态。用------盐处理基因组dna，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计bsp引物进行pcr，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对pcr产物进行测序就可以判断cpg位点是否发生jia基化，称为bsp-直接测序法。将pcr产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为bsp-ke隆测序法。
特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。
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