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细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期：

细胞周期：指细胞从---次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由g0/g1期、s期、g2期和m期组成。g0/g1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（g0期），而g0期从dna含量上无法与g1期区分，细胞开始rna和蛋白质的合成，但dna含量仍保持二倍体。s期：dna开始合成，细胞核内dna的含量介于g1期和g2期之间。g2期和m期：当dna成为4倍体时，细胞进入g2期。g2期细胞继续合成rna及蛋白质，直到进入m期。

pi法是---的周期检测方法。pi为插入性---荧光染料，能选择性的嵌入---dna和rna双链螺旋的碱基之间与之结合，流式细胞，其结合的量与dna的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的dna分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-pi染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(ps)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测ps的表达，转染，能反映早期凋亡。annexinv是ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对ps有---的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的ps相结合。利用这一原理，可以将annexinv标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用annexinv-fitc和碘化丙啶(pi)来区分凋亡和坏---。pi的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

一般流程：细胞收集-pi-annexinv标记-流式细胞仪检测。

结果示例：

                                   图 a 细胞周期检测图；b 细胞凋亡检测图

细胞冻存有哪些注意事项？

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，甘肃细胞，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分---。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。

细胞冻存的步骤：

配制含 10%dmso 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;

取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 pbs 清洗。

去除 pbs，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞---下来;

离心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;

将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;

冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，细胞系，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。