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大鼠gu髓间充质gan细胞的分离

操作方法

(1 )取sd大鼠( 2周龄)，颈椎脱臼法处死后立即用75%---浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉， pbs溶液冲洗两遍。

(3 )从中间剪断股骨和胫骨，用2ml无菌注she器吸取dmem/f 12溶液冲出gu髓细胞多次，再用针头吹打，吸管吸入离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，用pbs重悬细胞。

(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，细胞实验外包公司，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。

(5 ) 2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)， pbs洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的dmem/f 12以106/ml的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中， 置37°c、5%co2恒温培养箱中培养。

( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况)，pbs冲洗2-3次去除末贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，-般10d细胞生长融合。

(8 )经0.25%胰酶---，1 : 2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长---的第三代细胞进行后续实验。

平板克l隆形成实验基本步骤::

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰 蛋白酶---并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛的dmem培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含10ml 37预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37团5% co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的时，终止培养。弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4%---固定细胞5ml固定15分钟。然后去固定液，加适量gimsa应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的数。后计算形成率。形成率= (数/接种细胞数) x100%平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞- -定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。