pcr实验室-浙江pcr-英瀚斯

18.引物是经过page纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论---析型page变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备page电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，page纯化的引物，---是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少od数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. taqman 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆taqman 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆g-c含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，---是要避免gggg或更多g出现。

◆在引物的5端避免使用g。

◆选用比较多的碱基c。

◆退火温度tm控制在 68-70c   左右。

有用的荧光染料参数

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

一、主要方法

1. 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到）。

2. 按照配体特性的分离-亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质）。

3. 低温沉淀法，使用如，---等与水可混溶的，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，实时定量pcr，和盐析相比较，---，这种方法的分辨率的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。

4. 按照分子大小不一样的方法，浙江pcr，密度梯度离心（在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的和密度，和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤（一种柱层析）；超过滤（利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质）。

5. 按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析（使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小）；（因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0，使分子间静电斥力减少了，所以，---沉淀比较容易，这时具有小的溶解度）。

6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。