---怎么做-英瀚斯-台州pcr

动物组织细胞基因组dna提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶k

（500ug/ml）20μl，---怎么做，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul te 重新溶解。（可进行pcr反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l氨加入2倍体积的无水---，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%---洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul te重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?c20℃保存备用。

10.吸取适量样品于genequant上检测浓度和纯度。

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚---胺三酯法。dna合成仪有很多种，实时定量pcr， 主要都是由abi/pe 公司生产，而bioneer自行研制的384并行高通量dna合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚---胺三酯法合成dna，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚---胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′***5′磷酸二酯键连接。

步是将预先连接在固相载体cpg上的活性基团被保护的核苷酸与---反应，脱去其5′----的保护基团dmt，获得游离的5′----。

第二步，合成dna的原料，亚---胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，荧光定量pcr，5′----仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′----发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′----没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，台州pcr，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚---形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以---脱去它的5′----上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合---率。

通过---高温处理，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc，和page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。