二、脂质体转染操作步骤
1、操作步骤 [方法一]:
(1) 细胞培养:取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿),向每孔中加入 2 ml 含 1~2×105 个细胞培养液,37℃ co2 培养至 40%~60% 汇合时 (汇合过分,细胞实验室,转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备:在聚---乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)a 液:用不含培养基稀释 1-10 μg dna,终量 100μl,b 液:用不含培养基稀释 2-50 μglr,终量 100μl,轻轻混合 a、b 液,单细胞测序技术,室温中置 10-15 分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 lr 或 dna 浓度过高所致,流式细胞检测,应酌情减量)。
(3) 转染准备:用 2 ml 不含培养液漂洗两次,再加入 1 ml 不含培养液。
(4) 转染:把 a/b 复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃ 温箱置 6~24 小时,吸除无转染液,换入正常培养液继续培养。
(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意:转染时切勿加,对转染效率有很大影响。
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---是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程,其结果是在空间上细胞产生差异,在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。---的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达,通过不同基因表达的开启或关闭,终产生---蛋白质。细胞---是指将一群不同类型或者形态结构、功能特征存在差异的细胞通过生物学、物理学等手段,将之转变为具有相似/相同形态结构、功能特征的细胞群体的过程。
细胞培养中常见的污染及解决方法
支原体污染
支原体是隐蔽的污染物,不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象,比如细胞病变和浊度或 ph 值变化(即使在---污染的培养基中),这样就会导致我们产生错误的---。而在牛中,支原体是常见的微生物之一。
解决方法:通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染,湖南细胞,---是对重要的细胞系,必须去除支原体,一般的方法有、抗和抗与补体联合。值得注意的是,支原体很---的结构特征是没有细胞壁。因此,它对作用于细胞壁的生物合成(如 β-内---类、万古等)完全不敏感,并且通常对多粘菌素、---和类具有耐药性。相反,四环素类和大环内酯类对支原体的抑制作用很强,而---糖苷类和氯的抑制作用较弱。
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