海南pcr-南京英瀚斯生物科技-pcr实验室

二、大肠菌群检验方法:

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的---，即:需氧及兼性厌氧、在37°c能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有和原商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

(一):采用三步法，pcr实验室，即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36士1c培养48土2h，观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°c培养18-24h，观察菌落形态。证实试验:挑取平板上的菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36士1°c培养24土2h，观察产气情况。

报告:

根据证实为大肠阳性的管数，查mpn表，报告每100ml ( g)大肠菌群的mpn值。具体操作参见gb4789. 3-94 <------食品卫生微生物学检验大肠菌群测定>

(二)原商检局制订的行业标准，等效采用美国fda的标准方法，用于对出口食品中的大肠进行检测。本方法采用两步法：推测试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管lst肉汤。36士1c培养48士2h，观察是否产气。证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(bglb)肉汤管中，36士1°c培养48士2h，观察是否产气。以bglb产气为阳性。查mpn表，---，报告每ml(g)样品中大肠菌群的mpn值。具体操作参见sn0169-92<------进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠检验方法>

聚合酶链式反应(pcr)

操作步骤

1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1qpcr buffer

5 μl

dntp mix( 2mm )

4 μl

引物1(10pm)

μl 2

引物2 ( 10pm)

2μl

taq酶(2u/ul)

1 μl

dna模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddh2o至

μl 50

视pcr仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c

预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循环30-35

次，后在72°c保温7min。

3.结束反应， pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。

4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以

除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。