逆转录---构建及包装
逆转录---（retrovirus）是一类rna---。在逆转录酶的作用下，以---rna为模板合成cdna再通过dna、转录、翻译等过程形成---颗粒。逆转录---表达系统是一种新的重组蛋白表达系统，由逆转录---载体、辅助载体（表达---包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。逆转录---载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。逆转录---载体主要优点：转染范围广，可以各种细胞类型，转入的外源基因可完全融合，对细胞率高，细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因。
逆转录---载体系统共有两部分组成：包装细胞系和缺陷---本身。在逆转录---载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号，通过分子技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供---载体包装成---粒子所需的结构蛋白。当重组---载体导入包装细胞后，缺陷---载体和包装细胞的互补作用共同完成---装配，该---颗粒可其它宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录---提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒，---了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。
16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是---pcr扩增，不可能---扩增产物中没有突变，引物合成也不可能---100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保---温聚合酶pcr扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
17.如果测序发现突变，该如何处理？
答：遇到这种情况，首先和---合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，可能会找到正确的。根据经验，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的---是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个突变的位点都不一样，实时荧光定量pcr，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
20.primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆g-c含量控制在40-60%左右。
◆避免近3端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3端5个碱基有2个以上的g或c。
◆如果可能避免在3端1个碱基为a。
◆避免连续相同碱基的出现，---是要避免gggg或更多g出现。
◆退火温度tm控制在 58-60c 左右。
◆如果是设计点突变引物，河北pcr，突变点应尽可能在引物的中间。
21.为什么引物的od260/od280小于1.5 ？
答：引物应该全是dna，pcr，但是od260/od280的比值为什么那么低，---怎么做，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要---的是od260/od280的比值不能用来衡量引物的纯度。od260/od280的比值过低一般是由于引物中c/t 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的od260/od280的比值，清楚表明od260/od280的比值与引物的碱基组成密切相关。
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