聚合酶链式反应(pcr)
操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
视pcr仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置pcr仪上执行扩增。-般:在93°c
预变性3-5min ,进入循环扩增阶段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ,循环30-35
次,后在72°c保温7min。
3.结束反应, pcr产物放置于4°c待电泳检测或-20°c长期保存。
4. pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100ul进行抽提反应混合液,以
除去石蜡油;否则,实时荧光定量pcr,直接取5- 10μl电泳检测。
str检测
短串联重复(short tandem repeats, str),又称微wei星dna(microsatellite dna)或简单重复序列(--- repeat sequence, srs或ssr),是广泛存在于原核生物和真核生物基因组中的核苷酸重复序列。有丝分裂过程中dna链之间的错配引起的fu制滑动被认为是导致str产生的较为常见原因,并且依据不同fu制单元大小的不同以及不同物种之间,fu制滑动发生的概率也不相同。
str是以序列 (core repeat units) 首尾相连多次重复形成。每个str的序列结构相同,长度为2-6bp,---怎么做,但其重复单位数目和重复区域的长度不同,榆林pcr,因此str在不同种族、不同人群之间的分布具有差---,构成了str遗传多态性。不同个体之间在一个同源str位点的重复次数也不同,因而同指纹识别一样,str位点分析也可对个体进行身份识别。通过识别个体基因组在特定位点的特定序列重复,即可创建其基因档案。基于此,str分析法已经成为一种重要的鉴定分析方法,应用于---学、qin子鉴定及细胞鉴定等领域。
microrna芯片:
rna干扰(rna interference, rnai)现象是一种进化上保守的抵御或外来---qin犯的防御机制。将含有靶基因mrna同源互补序列的rna(double strand rna, dsrna)导入细胞后,能够特异地识别该mrna,引起mrna的降解,从而导致相应的功能缺失。rnai提供了一种经济、快捷、gao效的抑制特异基因表达的技术手段,该技术已被广泛用于研究基因功能和chuan染性---及恶xingzhong瘤基因zhi疗领域。目前常用的rna干扰手段为mirna、 shrna和sirna等。
mirna是一类可以通过rnai机制调节基因表达的内源性小rna,人工mirna与shrna的设计原理基本相同,由于mirna具有内源性,因此其更易产生有效的基因沉默。
技术流程:
dsrna或pre-mirna被导入细胞后,能够被一种特异的---内切酶(dicer)识别并切割成为小片段,这些片段在rna解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成rna---的沉默复合物(rna-induced silencing complex,risc),实时定量pcr,risc与mrna同源区进行特---结合,若mirna与mrna的结合位点配对,则切割mrna;若mirna与mrna的结合位点不配对,则抑制mrna的翻译。
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